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肿瘤微环境与正常或肿瘤上皮肝细胞关系之综述

2021年07月16日 08:44 转发自解螺旋 点击:[]

2021年1月5日,温伯格又在国际著名期刊、影响因子高达60.7分的Nature Reviews Cancer发表了题为《Linking EMT programmes to normal and neoplastic epithelial stem cells》的远景综述,系统性的阐述了EMT与正常和肿瘤上皮干细胞之间的联系。


为了帮助大家更好的吸收综述的内容,榨干其每一滴精华,本工在阅读综述的时候,也给大家翻译了遍,希望能给大家带来有真正价值的“学术营养”。





摘要


上皮干细胞可通过其自我更新和产生更专一和分化的细胞类型的能力,在不同组织的传代、维持和修复过程中发挥关键的生理功能。以类似的方式,癌症干细胞被认为是许多肿瘤生长、进展和复发的助推器。上皮-间质转化(EMT)是一种参与发育和伤口愈合的潜在细胞生物学过程,它的激活与正常和肿瘤干细胞的形成有关,但这种联系背后的机制基础仍不清楚。


在本文中,我们概述了EMT与正常和肿瘤性上皮干细胞有关的情况,并考虑了该过程在组织再生和修复中的参与情况。我们还讨论了与EMT过程所产生的异质性和可塑性细胞状态有关的新概念和证据,以及这些内容如何影响我们对癌症干细胞生物学和癌症转移的理解。更全面地阐述EMT过程和干细胞状态之间仍然难以捉摸的联系,必将促进我们对正常干细胞生物学和癌症发病机制的理解。



简介


很多甚至可以说所有的上皮组织都是由干细胞所维持的,干细胞有两种显著的特征:一种是自我更新的能力,从而维持干细胞库;另一种是分化的能力,以产生子代细胞来执行与上皮组织有关的特殊功能。这种干细胞对于发育过程中上皮细胞的产生和扩展、组织平衡所需的细胞持续补充以及组织受损时所需的细胞替换都至关重要。


正如干细胞可以支持正常上皮组织一样,在描述源自这些组织的癌症生物学时出现了一个类似的概念:这些肿瘤隐藏有可助长肿瘤生长的少数癌症干细胞(CSCs)。癌症干细胞在植入小鼠宿主体内后能够启动肿瘤生长,因此被定义为癌症干细胞,并在功能上得到了确认,因此常常被称为 "肿瘤起始(tumour-initiating)细胞"。此外,鉴于CSCs在启动肿瘤生长和抵御各种治疗手段方面所具有的显著能力,CSCs也被认为是推动癌症进展的黑手,是肿瘤转移和疾病复发的细胞种子,这也是临床肿瘤学中最棘手的两个挑战。


不同类型的CSCs在肿瘤进展的不同阶段,如原发肿瘤的生长、对治疗的抵抗和转移的播种,都有可能,甚至很有可能介导了不同的过程。CSC模型的一个主要含义是,许多癌症与相应的正常上皮组织类似,是以分层的方式组织的,而CSCs在这种细胞层次结构的顶端占据了关键位置。事实上,在皮肤、肠道、大脑和乳腺等肿瘤发生小鼠模型中进行的系谱追踪实验结果也支持CSCs的存在和这些肿瘤的分层组织。


2008年,科学家报道了一个奇特而有趣的联系(link):被称为“上皮-间质转化”(EMT)(图1)的细胞生物学过程的激活可以诱导正常和肿瘤性上皮干细胞的形成。




EMT最初被描述为一种发育过程,由上皮细胞所部署,在发育过程中必须移动到胚胎中的远处位置,例如在胃发育或各种细胞类型从神经嵴移出的过程中。在成年上皮组织中,EMT构成了对创伤的生理反应的一部分,并可在某些病理条件下被激活,例如纤维化和癌症。原则上,由EMT引导(choreographed)的细胞表型的转变是可逆的,因此,已被激活了EMT过程的单个细胞可以也经常通过间充质-上皮转化(MET)恢复到上皮状态。


EMT过程是由细胞所接触的旁分泌信号因子,特别是转化生长因子-β(TGFβ)在细胞中所诱导的。其他各种信号,包括WNT蛋白、细胞因子、生长因子和细胞外基质(ECM)-整合素的相互作用,也能诱导这些过程,而且往往以各种组合的方式在上皮细胞中引起EMT。最终,这些信号导致EMT过程的各种主调控因子发生诱导性表达和功能激活,特别是EMT诱导转录因子(EMT-TFs),它们能够多向性地协调与EMT相关的各种转录变化。


这个EMT-TFs核心包括SNAIL家族成员(SNAIL,由SNAI1编码,SLUG,由SNAI2编码),TWIST家族(TWIST1和TWIST2)和ZEB因子(ZEB1和ZEB2)。然而,其他转录因子,如PRRX1和FOXC2也能诱导EMT。




其他的调控方式可由某些microRNAs以及剪接的转录后调控和蛋白质稳定性的翻译后控制来提供。多层次调控网络的数学模型表明,EMT过程可能会产生一些处于完全上皮和完全间质两极之间的中间或部分间质表型状态的细胞,这一预测也已被许多生物学观察结果所证实。因此,EMT过程的激活导致准间质细胞状态的异质性混合,细胞可沿着这个表型谱系来回移动。


因此,EMT不是作为一个二元开关在上皮和间质状态之间切换,而是作为一个动态过程的连续谱来描述各种不同表型的细胞。此外,由于EMT过程的执行可能被细胞所经历的环境信号和这些细胞原来的分化谱系所影响,所以EMT不能被看作是一种单一的、刻板的过程,而应该被看做一个有许多共同成分的过程的概况/集合。


在肿瘤发病机制方面,之前潜在的EMT过程激活使得高级别肿瘤的癌细胞产生了一些临床上与恶性肿瘤相关的表型,特别是促进癌细胞向远处器官播散,并促进其对包括免疫疗法在内的各种治疗方案的抵抗性。这些细胞行为大多可以通过上皮细胞向间质表型过渡时的细胞反应来解释。然而,与干细胞状态之间的关联还未确定,仍存在许多的问题。在细胞生物学层面上,为什么某些描述中(versions)的EMT会在正常和转化的上皮细胞群中产生干细胞样的细胞?EMT过程的哪些方面与干细胞状态有内在的联系?使EMT过程产生正常和肿瘤性干细胞的分子机制有多大的相似性?


在本文中,我们将以两种方式来处理这些问题。首先,我们考虑正常上皮细胞,强调将EMT与成体干细胞及其参与上皮组织的修复和再生相关联的证据。然后,我们继续讨论最近对上皮-间质可塑性动态的发现,对细胞沿上皮-间质轴而产生的各种表型状态的进一步了解,及其如何影响我们对CSC生物学和转移的理解。



上皮干细胞中的EMT


干细胞通常可通过其表现出来的某些分子标记特征来识别,这些标记可用于分离这些细胞,并在移植试验中评估其干细胞潜力,或进行系谱追踪研究,以确定其命运及其在活组织中的后代。对于某些上皮组织,已经确定了定义明确的常驻干细胞群,它们通常占据独特且精确定位的微环境生态位。如本文所述,最近的研究强调了单层(简单)和多层(分层)上皮的生物学差异,即在其各自的干细胞区室(compartments)内发生EMT。


1

分层的上皮细胞


EMT过程和上皮干细胞之间的相互作用在乳腺中得到了最广泛的研究。该组织由两层上皮细胞组成,包括两个主要的细胞系:内层的管腔细胞排列在导管和肺泡(alveoli)上,外层的基底细胞则直接位于基底膜上。在之前,乳腺干细胞(MaSCs)在实践上的定义为:移植到小鼠乳腺脂肪垫上时具有重建乳腺上皮能力的细胞;这些细胞首先与定植在基底层的CD29(hi)CD24+小鼠细胞群相关。各种其他标记物,包括蛋白C受体(PROCR)、LGR5和BCL11B,被发现富集在MaSCs的不同亚群,而且似乎所有基底细胞的相当一部分(可能超过一半)都具有腺体重组的潜力。


相对于管状细胞,从小鼠乳腺中分离出来的基底细胞在体外培养时表现出间质形态,并伴随E-cadherin水平降低;它们在体内产生的少量E-cadherin会不对称性地分布在与管状细胞直接产生物理接触的细胞表面。此外,基底细胞也表达一些间质基因,如编码N-cadherin和vimentin的基因,其表达水平也达到了可被清晰检测到的程度。这种基底基因表达模式可以被描述为弱表达EMT过程的特征,在这种情况下,可以通过EMT-TF SLUG在这些细胞中的补充性(tonic)表达来作为机制解释。基底细胞的亚群也被报道可表达其他的EMT-TFs,包括ZEB1、ZEB2和TWIST1。


胚胎干细胞和EMT之间的关系也非同一般,因为SLUG的功能已经在小鼠胚胎干细胞中得到了广泛的研究。例如,使用可表达SLUG-黄色荧光蛋白(YFP)转基因报告的小鼠乳腺细胞,发现在植入乳腺脂肪垫后,其腺体重建的能力完全位于SLUG+亚群的细胞内。此外,瞬时性实验驱动SLUG在从成年腺体收获的小鼠乳腺上皮细胞群中过表达后,增加了MaSCs的数量,根据乳腺重建的定义,增加的数量可能达到两个数量级。当与先锋转录因子SOX9的诱导表达相结合时,SLUG可将完全分化的腔内细胞重编程为自我更新的造血干细胞。


相反,SLUG(以及SOX9)是维持造血干细胞活性所必需的,这一点通过功能缺失(loss-of-function)实验得到了证明,削弱MaSCs在培养中形成类器官或在体内重建乳腺脂肪垫的能力。尽管如此,缺乏SLUG编码的Snai2基因的小鼠会表现出乳腺形态发生的延迟,但最终仍成功地发展出了功能性腺体。


SLUG的一个重要功能可能来自其抑制管腔分化的能力,从而使细胞保持在基底细胞状态。值得注意的是,当瞬时表达SNAIL基因时,而不是TWIST1,可以取代SLUG将小鼠管腔细胞重编程为MaSCs,至少在体外类器官实验中是这样的。这表明,虽然这两个同源转录因子所引起的EMT过程可能相当不同,但SLUG和SNAIL都能引起类似的生物反应,是干细胞状态的核心。


有一个很重要的特点值得注意,即定植在完整乳腺内的上皮细胞的实际命运可能与移植试验所表现出来的分化潜力不同。事实上,在成年小鼠的腺体中,腔内和基底细胞似乎是由单独的单能祖细胞池所维持的,这表明在这个已完全成形的腺体中可能不存在真正的多能乳腺细胞。


然而,在胚胎中,双能干/祖细胞已被发现,并得到了多个研究团队的研究和表征。在小鼠胚胎发育后期(胚胎的第18.5天)所扩增的胎儿造血干细胞,以及在胚胎发育早期(胚胎第14天)所分离出来的胚胎多能祖细胞,都显示出有与管腔和基底系相关的基因表达。胚胎多潜能祖细胞可表达许多间质基因,包括编码各种EMT-TFs的基因,如SLUG、PRRX1和ZEB2。此外,胎儿造血干细胞可表达转录因子SOX10,已被证明其能赋予干细胞特征和间质特征。


如上所述,基底造血干细胞可以重新填充被清除的脂肪垫乳腺上皮,这一结果似乎反映了这些细胞群中存在固有的多能发育潜能,这些细胞很像发育过程中存在的细胞。或者,这些细胞可能是在小鼠乳腺脂肪垫的植入和随后的生长过程中才获得这种潜能。为了支持后一种观点,最近的研究也发现小鼠基底细胞在管腔细胞被遗传消减(ablated)时可获得多潜能;多潜能是通过一种特殊程序过程实现的,该过程涉及获得混合管腔和基底细胞的表型和发生EMT相关基因的上调。这些结果表明,管状细胞会限制邻近基底细胞的干细胞潜力,这也为基底细胞在原位的命运与移植试验中的干细胞潜能之间的差异提供了解释。


除了表达某些核心的EMT-TFs外,人类和小鼠造血干细胞还表达p63的氨基端截断异构体(ΔNp63,以下简称p63),这是一个基底相关的转录因子,已被证明是多层上皮组织中干细胞的主要调节因子。确切地说,p63驱动的转录程序与SLUG协调的转录程序是如何相互关联的,目前仍不清楚。无论其机制细节如何,基底干细胞、p63和部分EMT过程的激活之间还是存在有很多的相互关联,这种特征甚至会在所有分层上皮组织中反复出现(图2),我们将在后面更详细地讨论。此外,这代表了多种分层上皮组织的共同特征,表明这种组织在脊髓动物系统发育的早期就已经形成,并在此后发育成有多样功能的组织。




前列腺的假复层上皮由管状细胞、基底细胞和神经内分泌细胞所组成。与乳腺一样,前列腺干细胞可以在基底层中找到,并且已经发现单个基底细胞就能够在小鼠身上移植再生前列腺上皮。然而,与相应的乳腺细胞相比,小鼠前列腺和人类前列腺中的管线细胞也具有干细胞的潜力,至少在雄激素剥夺后的再生反应中是如此。尽管成年腺体似乎主要由单能的管状和基底祖细胞所维持,小鼠前列腺与乳腺不同的,小鼠前列腺的多能基底干细胞一直持续到出生后的早期发育。


从乳腺研究中延伸出的概念模型,在前列腺内、小鼠基底细胞中(Lin阴性、SCA1阳性、CD49 fhi阳性、TROP2阳性)也已被证明具有干/祖细胞特性,包括在体外形成克隆球和多向分化的潜力。从小鼠和良性人前列腺样本中分离出的TROP2+细胞具有部分间质基因的表达特征,并表达SLUG。这一细胞群也表达p63基因,该基因为前列腺发育所需。从小鼠中用SLUG-YFP报告系统所分离出的SLUG+细胞,与SLUG-细胞相比,形成器官组织的能力明显增强,这些器官组织似乎还包含所有三种前列腺上皮细胞亚型(基底层、管腔层和神经内分泌层)。


至少在前列腺中,分子的调控与有限的前列腺基底细胞亚群比例(约1%)相关,这些细胞位于尿道近端,已被定义为干细胞生态位的部位。最近的研究发现这些细胞可表达EMT-TF ZEB1。隔离这一稀有的细胞群后,使用类似于上述SLUG报告系统的基因敲入标记策略,证明Lin- SCA1+ CD49fhi ZEB1+的细胞中富集有前列腺干细胞。功能缺失实验还进一步表明,ZEB1是基底细胞分化的一个关键媒介因子。综上所述,这些研究表明某些EMT-TFs在调节前列腺和乳腺上皮的基底干细胞中具有功能性作用。


除乳腺和前列腺外,SLUG已被发现可在小鼠分层和假复层上皮中广泛表达,当然也局限于这些组织的基底细胞。其他研究中的例子还包括肺部和皮肤的上皮细胞。在上呼吸道的假复层上皮中,小鼠和人基底细胞都是可自我更新的低能干细胞,能够分化成分泌、纤毛或神经内分泌细胞,并有SLUG基因的表达。同样,SLUG也在毛囊和小鼠毛囊间表皮的基底细胞中表达,在皮肤的这两个位置中有常驻干细胞群存在。Snai2 -/-的小鼠会表现出相当温和的表型,包括表皮变薄和毛发生长延迟。因此,虽然SLUG对分层上皮的发展不是绝对必要的,但它似乎在组织的平衡中发挥着作用,比如调节不同组织中基底和管腔细胞的比例。


最后,虽然我们关注上皮组织,但我们注意到SLUG也已被认为是某些非上皮干细胞的重要调节因子,如造血干细胞、间充质干细胞和肌肉干细胞。这表明EMT与干细胞的联系可能在进化的早期就已经形成。


2

单层上皮细胞


与SLUG会在分层和假复层上皮组织中的广泛表达相反,在小鼠全身的简单、单层上皮中(如在胃、肠、胰腺、肝和肺泡中)都没能检测它。因此,维持简单上皮组织的干细胞并没有表现出任何间质极化的证据(图2)。




一个很好的例子是LGR5+干细胞群,它定居在肠隐窝的底部,并受到活跃的经典WNT信号所控制。小鼠隐窝底部的LGR5+柱状细胞已得到广泛的研究;虽然在这些分析中出现的肠道干细胞基因表达特征不包括任何编码EMT-TFs的基因,但编码转录因子SOX9的基因,即前面提到的乳腺上皮干性的共同调控因子,是该特征的一部分。与这些结果相冲突的是在其他的研究中发现了另外一些现象,即在小鼠和苍蝇肠道中存在EMT-TF SNAIL,而干细胞也被证实存在于这些区域。如果得到了验证,这将表明EMT-TFs的SNAIL家族成员与多层上皮细胞的干性特征有关。


肺部远端部分的肺泡提供了上皮干性和EMT之间关系脱节的另一个例子。肺泡2型细胞作为干细胞,与上呼吸道的基底细胞不同,尚未有报道发现肺泡2型细胞可表达p63或SLUG。同样地,支气管肺泡干细胞是另一个被发现的干细胞群,存在于小鼠肺部,但这些细胞是否表达SLUG则尚不清楚。


成体上皮干细胞的这种明显的基本二分法--分层上皮的干细胞利用EMT过程的各个部分,而简单上皮的干细胞则不利用,这一现象的功能原理仍然完全不清楚,尤其是它们经常还依赖相近的信号通道,如经典的WNT通路。


一个独立又相关的问题是关于基底细胞表达部分EMT过程的信号性质:SLUG的组成性表达是否由一组类似的旁分泌因子所维持,这些因子是否在伤口愈合或癌变过程中激活EMT过程?基底细胞在基底膜上的微观定位可能表明某些整合素-ECM的相互作用参与了这种细胞状态的维持,但这种机制很难与简单上皮组织的干细胞行为相协调,这些干细胞也停留在基底膜上,但显示出完全的上皮表型。


最近的研究有了一个有趣的解释,即顶端-基底的极性调节可强烈抑制EMT在细胞内信号通路。因此,由于其顶端-基底极化的性质,简单上皮的干细胞可能会抑制某些诱导EMT的信号。相反,分层上皮的基底细胞缺乏这种顶端-基底极性,这可能使它们能够激活部分EMT过程。



组织修复和再生中的EMT


除了在组织稳态中的核心作用,上皮干细胞在应对组织损伤时也其关键作用。因此,干细胞在受伤时可以被激活,以加快组织的修复和再生。同时,先前完整的上皮细胞的物理破坏本身也足以激活一些相关细胞的EMT,使这些细胞迁移到伤口部位。干细胞和EMT对伤口愈合的作用也是互补的,这也可能为这两个过程在上皮组织中相互关联的原因提供了理论基础。在本文中,我们以皮肤和肺部为重点探讨这种联系,这是关于组织损伤和再生的两个已被充分研究过的例子。


皮肤伤口愈合的反应主要经历三个阶段:初始炎症反应,再上皮化的再生阶段和以ECM重塑为特征的最终完成阶段。在再上皮化的过程中,表皮细胞表现为部分EMT诱导的表型,因为它们集体向伤口部位迁移。事实上,早期的研究发现,小鼠伤口边缘的表皮细胞诱导了SLUG的表达,这一发现在人类角质细胞单层伤口的体外实验中也得到了验证。最近的单细胞分析证实了对小鼠皮肤伤口的反应诱导了EMT特征。SLUG似乎在表皮生长因子受体(EGFR)的下游起作用,EGFR是再上皮化的一个重要媒介因子,SLUG的缺失会破坏小鼠的伤口愈合反应。


然而,这些研究并没有理清楚EMT过程在正常干细胞区室中对组织损伤所起的确切作用。在作为伤口愈合反应的一部分而发生的再上皮化过程中,伤口部位边缘的上皮细胞群会大规模地推进到因伤口而失去上皮的区域。这些前进细胞群的前缘表皮细胞表现出最突出的EMT特征,且是不增殖的,而积极增殖的细胞定居在离前缘有一定距离的外侧区域,被称为“增殖中心”。在这个过程里,进入伤口部位的准间质细胞(由EMT过程促成)和那些参与积极增殖和恢复适当细胞数量的细胞(由干细胞程序驱动)之间似乎存在着脱节。


虽然小鼠毛囊间表皮中通常表现为周期缓慢的基底干细胞群对修复过程有很大贡献,但通常局限于皮肤其他位置的干细胞,如位于基底、峡部和毛囊隆起的干细胞,也可以被动员起来帮助修复上皮细胞。EMT的某些方面是否参与了这些干细胞及其子代细胞的转移,以及EMT过程是否与在受伤后干细胞中所观察到的谱系可塑性上存在机制上的联系,这一点仍是未知数,因为其中的细胞可暂时性地表现出多个通常不同细胞系的分子特征。与此可能有关的是,毛囊干细胞在发生致癌性转化后就准备好发生EMT了,而且对创伤和转化的分子反应非常相似。这些类似的细胞行为最终可能是由共同的、预先存在的染色质构型所决定的。


肺部上皮细胞通常比皮肤上皮细胞的更新速度更慢,但仍表现出显著的再生能力,以应对损伤。和皮肤一样,肺上皮是由独立的干细胞池所维持的,这些干细胞定居在不同的解剖位置:近端气道由p63+基底干细胞所维持,而肺泡2型细胞则是肺泡内的干细胞群。


然而,在应对损伤时,正常的细胞层次和典型的谱系限制会被打破,许多不同的细胞群可以促进组织的修复。例如,对小鼠基底细胞群进行实验性消融后,管腔分泌细胞可分化为功能性干细胞。在小鼠遭到严重流感的损伤后,远端气道中罕见的p63+、角蛋白5(KRT5)阳性细胞会被激活并迁移到受伤的肺泡,在那里可以促进再生。


鉴于这一特定亚群的基础定位、p63的表达和明显的迁移能力,我们认为有必要对SLUG和EMT过程的其他组成部分对再生作用的潜在作用进行研究,以此进一步加深对干细胞和EMT之间关系的认识。


其他肺损伤小鼠模型也证明了EMT会参与干细胞对创伤的反应。在小鼠气管中,上皮的恢复与基底干细胞的β-catenin激活有关,这一过程似乎本身就能促进某些间质特征。在气道的更远端,一种潜在的类干细胞亚群也具有再生潜力(也被称为变异类干细胞),有证据表明这些细胞对损伤的反应涉及与SNAIL表达相关的短暂EMT。


这些细胞也有助于在肺毒物博莱霉素造成损伤后的肺泡修复,而短暂的EMT会促进它们迁移到肺泡中。最近对小鼠博莱霉素再生反应的单细胞RNA测序分析发现了一种过渡性干细胞状态,称为“肺泡分化中间体”,在多种肺部损伤模型中都有发现,该状态表现为EMT基因表达特征的强烈激活。这些研究表明,整个呼吸系统的上皮细胞在应对各种形式的损伤时,都会激活一种部分EMT过程,而过渡到干细胞状态可能是肺部不同再生反应的一个共同特征。


最后,需要将能反映部分EMT过程激活的遗传报告基因与单细胞RNA测序分析相结合,以明确各种上皮组织再生过程中EMT赋予的表型可塑性在干细胞中的功能。在简单上皮组织中,例如在肠道中,常驻的干细胞似乎是完全上皮的。在肠隐窝中,静止的、兼性干细胞群,甚至很多分化的肠上皮祖细胞在某些条件下可以作为储备来补充干细胞池,但目前还不知道这些细胞状态的转变是否涉及EMT过程的激活。


组织损伤诱导EMT的生物机制仍不明确,但可能来自两种不同类型的信号。首先,伴随明显炎症反应的损伤可以产生大量可溶性的EMT诱导的旁分泌信号,如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β。另外,上皮细胞物理连续性的局部破坏和伴随的同型细胞-细胞粘附性相互作用的丧失,可能本身就激活了导致EMT的细胞内在过程。


因此,在单个细胞内,粘附性连接的丧失(通常用于将大量的β-catenin分子封存在质膜下的近膜位点)可能会释放这些分子,使其转移到细胞核中,在那里与其他转录因子结合,从而激活EMT-TFs的表达。鉴于β-catenin在干细胞生物学中的作用已被广泛报道,这些相互作用可能有助于解释这种分子在细胞中两个不相关的部位的不同功能,即在细胞质中作为一个关键的结构蛋白,而在细胞核中作为一个转录辅助因子。事实上,在EMT过程中,β-catenin从细胞膜释放出来的这一过程,可能是连接EMT过程和干细胞状态的中心信号通路。



CSCs中的EMT


EMT过程和干细胞状态之间的关系主要在癌症发病机制的背景下进行研究。继2008年最初的研究将该过程与乳腺CSCs的形成联系起来后,此后它又与一些其他实体恶性肿瘤的CSCs联系起来了。一些产生于简单上皮组织的癌症CSCs,如结肠癌和肺癌中的LGR5+ CSCs,似乎在很大程度上是上皮性的,而产生于其他简单上皮组织的癌症,如胰腺,携带的CSCs则表现出明显的间质特征并依赖于EMT-TF ZEB1。因此,当研究来自这两种不同组织类型的CSCs时,存在于正常简单上皮和分层上皮之间EMT过程的二分法也不再成立。


正如我们现在所知,EMT过程赋予了癌细胞多种有利特性。特别值得关注的是上皮-间质可塑性、CSC状态和恶性进展之间的关系。也有一些研究对癌细胞如何从原发肿瘤扩散并在远处重新启动增殖提供了可信的机制解释。在侵袭-转移级联的多个步骤中,EMT过程可能发挥两种不同的、互补的作用:使细胞从原发肿瘤扩散到远处组织的组织中,然后赋予扩散的肿瘤细胞(DTCs)所需的干细胞潜能,以作为转移性克隆的起始。近年来,这一研究领域也因为关于EMTs在转移过程中确切作用的争议和持续的问题而蒙上了阴影。在此,我们将讨论下最近的研究进展是如何帮助阐明这些令人困惑的问题。


1

EMT的异质性和转移性定植


EMT过程的激活导致部分间质细胞类型产生了异质性集合-具有与完全间质细胞相关的一些特征,但也不是全部,这一事实说明了围绕其与CSCs和转移的关系存在许多问题和疑点。


处于这种中间状态的细胞有时被描述为“混合型EMT细胞”,但我们在这里将其称为“准间质细胞”,这是一个更广泛的术语,它还包括了共同表达某些上皮和间质基因的干细胞。这个术语还包括在转录水平上表达CDH1(编码E-cadherin)但在细胞表面不表达E-cadherin的细胞,具有部分间质特征但没有明显表达核心EMT-TFs的细胞,甚至表现为主要是间质形态而没有明显上皮标记,但也没有达到极端完全的间质细胞状态。


通过实验高水平地表达各种EMT-TFs,EMT过程的全部推动因素则可以被发现出来,但由此产生的完全间质细胞并不能代表EMT过程在肿瘤发生中的作用。在一些小鼠肿瘤中,特别是那些p53缺失的肿瘤,可以产生似乎已经经历了完整EMT过程的肿瘤细胞,但我们认为人类的癌细胞很少甚至从来没有进展到完全间质细胞的状态,从而使这些过程/程序中的一些靠后的、更多间充质特征没有表现出来。


这种复杂的行为对于如何在实验中评估EMT的作用也具有重要的意义。举一个相关的例子,成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1;也被称为S100A4)是EMT过程的后期显著的间质标记之一。因此,FSP1不存在于通常只完成了部分该过程的癌细胞中,保留了某些上皮标志物,同时获得了细胞生物学特征,使其能够获得干性并从原发肿瘤向远处传播。


部分EMT过程的激活(以及相关的准间质性CSCs的形成)可能解释了为什么在小鼠中所进行的某些系谱追踪研究(使用由Fsp1特异性转录启动子激活的Cre重组酶标记细胞)未能在转移性癌细胞中发现先前EMT激活的证据。这也反过来产生了另外一个结论,即EMT过程对于转移性传播并不重要。


相比之下,其他实验提供了明确的相关证据,在同一个乳腺肿瘤小鼠模型中,发生了EMT的细胞尽管没有被Fsp1-Cre标记,但还是明显具有转移的潜力。最近,一种基于N-cadherin表达追踪EMT的新方法也发现,乳腺癌小鼠模型中大多数自发性肺转移都显示出先前存在暂时性EMT激活过程的明确证据。因此,若不能激活那些仅在EMT过程极性状态中才表达的标志物,就不能阻碍在恶性进展中的癌细胞表达那些能够为传播提供动力的成分。虽然早期的研究被一些人抓住不放,认为EMT程序的表达对癌细胞的转移性传播并不重要,但我们仍然认为,EMT过程的表达对所有类型癌细胞的转移性传播确实至关重要。


2

准间质型CSCs在癌症转移汇中的作用


关于EMT-转移性传播模型的研究结果显示,在皮肤癌和乳腺癌的自体模型中,有许多不同的准间质细胞类型。这项研究通过对众多准间质中间物的特征进行分析,提供了体内EMT激活的明确证据。虽然所有各种EMT诱导状态的细胞都具有肿瘤发生的能力,但那些仅通过间质程序/过程而部分进展的癌细胞其转移性最强,能够从原发肿瘤中扩散出去,并成为转移性克隆的起始。


在前列腺癌的小鼠模型中也发现了类似的结果,上皮/间质混合型和完全间质型的癌细胞都能诱导原发肿瘤发生,但完全间质型的细胞不能产生宏转移,而混合型的细胞则能。最近,人们发现,在鳞状细胞皮肤癌(包括小鼠和人类)和肺癌的小鼠模型中观察到了原钙粘蛋白FAT1的缺失,导致癌细胞能进入稳定的准间质细胞状态,而这种状态与获得CSC特性有关,包括转移定植。以上这些结果表明,处在EMT谱系上不同位置的细胞之间存在着重要的功能差异。如上所述,特别需要指出的是,准间质细胞才是远处转移的高效种子,而不是完全性间质细胞。


这些发现也可能有助于解释为什么TWIST1和SNAIL的长期高水平表达能有效地诱导EMT过程,但实际上却抑制了CSC的活动。同样,PRRX1也已被证明是一个能有效诱导EMT的因素,但只有在失去这个因素后才会进入CSC状态。一个可能的概括性解释是,这些不同EMT-TFs的持续表达推动了细胞完全通过EMT过程,使它们进入完全性间质状态,并脱离了准间质表型,而这似乎对它们的干性和转移的启动能力至关重要。


这些不同的证据导致人们越来越认为CSCs是某种介于完全上皮和间质两个极端之间的中间表型状态。事实上,人乳腺造血干细胞显示出了某些间质特征,并且最初也被从CD44+、CD24低和上皮细胞粘附分子(EPCAM)阳性部分的细胞中识别出来,这些细胞可以表达EPCAM,尽管这一现象经常被忽视,却也表明这种细胞其实处于部分间质状态。


最近,β4-整合素被用作从三阴性乳腺癌细胞系中分离准间充质CSCs的标记物。在实验中,通过表达SNAIL并用CRISPR敲除ZEB1基因,将人癌细胞困在这种状态,也产生了能高度致瘤的CSCs。在临床样本(包括原发肿瘤的活检样本和循环肿瘤细胞)中,在转移过程不同阶段所直接观察到的部分间质细胞也支持了这一观点。虽然有一些研究发现部分间质基因的表达特征与疾病预后不良有关,但也需要谨慎地解释这种结果,因为混合型EMT特征可能反映的是上皮和间质癌细胞的异质性混合物,而不是仅仅只是准间质细胞类型。


在实验中研究人员还发现EMT过程可以由多个替代性的EMT-TFs所触发。尽管这些转录因子在诱导EMT的能力上有所重叠,但它们所诱导的具体生物状态还是有些不同。这种部分多余的功能有助于解释为什么在胰腺导管腺癌的小鼠模型中,Snai1或Twist1的条件性敲除并不影响转移性进展,而在同一遗传模型中Zeb1的敲除则同时抑制了CSC表型和转移性定植。


3

EMT在转移性定植和休眠中的可塑性


上皮-间质的可塑性是决定转移能力的关键因素,现在已经积累了大量的证据阐述了MET对成功转移定植的必要性。这种思路将癌细胞描述为激活部分EMT过程以进行物理传播,然后在传播地点恢复到更多的上皮状态(因为上皮状态也是一个连续谱),从而在靶器官中建立癌细胞群。这种常能观察到的MET过程在转移性克隆中具有明显重要性的确切原因仍然不太清楚。最有可能的是,过渡到更上皮的状态可使细胞在完整的组织中更有效地增殖。




DTC进入远处组织后但没有恢复到上皮状态,这可能是某些在这些组织中保持休眠状态的DTC的行为基础。因此,在小鼠模型中,由HER2(也称为ERBB2)驱动的原发性乳腺癌早期扩散后在远处器官播种的肿瘤细胞仍处于休眠状态,其特点是TWIST1高表达和E-cadherin低水平表达。TWIST1的持续高表达可能可将这些DTCs保持在更多的间质状态,而这与细胞大量增殖是互斥的。


类似的结果也发生在直接从患者身上分离出来的癌细胞或患者衍生的异种移植模型中,休眠的DTCs或微转移病灶都表现出EMT激活和与之密切相关的基底干性样(stem-like)基因表达特征,表明其无法作为转移性克隆生长可能是由于它们产生更多分化的上皮细胞后代的能力被暂时或永久抑制了。根据这一结果,最近发现由原发肿瘤引起的全身性炎症反应能维持DTCs中ZEB1的表达,使其处于高度间质状态,从而防止其生长并形成宏转移。这种休眠的DTC最终可能会被唤醒并启动宏转移性生长,但这似乎需要它们过渡到一个更上皮的(即准间质)状态。


这一思路也带来了一个有趣的提示:休眠性DTCs可能在通过EMT而发生进展方面具有异质性,这一特质也决定了它们启动转移性定植的潜力。例如,具有高度间质特征的DTC可能比那些具有较温和EMT表现的DTC更难被唤醒,因此对长期复发所构成的风险较小。


总体而言,这些研究揭示了EMT过程中显著的复杂性和可变性。这种异质性的来源似乎反映了最初上皮细胞预先就存在的染色质状态、产生的众多替代性准间质细胞类型、触发该过程激活的各种旁分泌信号、协调该程序的特定EMT-TFs、EMT-TF激活的程度和持续时间,以及各种结果状态之间相互转换的时空动态变化。将这些考虑因素结合起来,使我们对EMT过程在转移过程中是如何运作的有了更全面的了解(图3)。




此外,DTCs的间质极化程度也可能影响转移性癌细胞对某些靶器官的明显倾向性,而不是其他器官。


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EMT和CSCs:一个开放性问题


尽管人们对准间质CSCs的概念目前正逐渐形成共识,但重要的问题仍未得到解答。一个问题是由EMT过程产生的过渡性表型状态的谱系是否如人们经常描述的那样,是一个间质特征逐渐增加的线性进展模式,并最终形成一个完全的间质细胞。有一些研究结果,如不同EMT-TFs可以发生顺序激活,似乎支持了这一观点。另一种可能性是,在这转化过程中存在其他的侧线,其轨迹可能受到其他的环境因素或现有的细胞内通路的影响(图4)。




单细胞测序方法确实也揭示了不同EMT轨迹的存在,但还是对这些替代路线的功能影响几乎一无所知。也许在这些路径中只有一部分会产生高度转移的CSC状态。此外,需要确定与CSCs相关的精确细胞状态,并制定策略以将这些细胞分离到纯净状态,是阻碍这一领域进展的关键问题。


另一个问题是,在肿瘤内,CSCs是否作为一个同质的细胞亚群而存在,或者说,在一个肿瘤内是否存在多种CSCs亚型,这也许是因为它们处在EMT过程的线性或多维地图的不同位置。例如,上皮样和间质样的人类乳腺CSCs被发现存在于同一原发肿瘤中:上皮样CSCs的醛脱氢酶(ALDH)呈阳性,并具有增殖能力,而间质样CSCs则处于CD44hi CD24-状态,并主要处于静止状态。细胞可能会在这两种CSC状态之间可逆性地转换,但它们在肿瘤中的总体特质可能也取决于具体的癌症亚型。微环境生态位也可能对间质极化的程度有很大影响,因为存在于EMT谱系不同点的癌细胞可在肿瘤中存在空间隔离。


上述多种类型CSCs的存在产生了另一个关于EMT过程、干性和细胞增殖之间关系的问题。众所周知,EMT的激活通常会减少或完全抑制细胞增殖,但目前仍不清楚这对干性特征的机制影响。在这种情况下,我们注意到存在周期缓慢、高度间质的CSCs与上皮更明显的增殖型CSCs这种二分法。至少概括地说,正常组织的细胞性组织中,维持上皮细胞的静止干细胞池可以被激活并在组织损伤时进行更广泛的增殖。


如前所述,一些CSC细胞群,如结肠癌中的LGR5+ CSC细胞群,已被证明是转移性定植的关键,而且似乎主要是上皮性的。然而,LGR5-细胞似乎主要负责最初播种到远处的器官,之后它们又过渡到LGR5+的CSC状态。这种类型的表型可塑性是否涉及EMT过程的作用也有待确定。


最后,调节这些细胞状态转换的动态过程也非常重要。例如,上皮细胞可能通过一个渐进的、线性的过程,逐步调整到更多的间质状态;或者,通过触发双稳态开关,如由miR-200-ZEB1轴控制的开关,过渡可能是非线性的、更突然的,具有滞后反应的特征。虽然非滞后性EMT仍能诱发癌细胞的形态变化和侵袭行为,但只有滞后性EMT与干细胞基因表达谱和产生转移性克隆的能力有关。


此外,这项研究显示,过渡到更多的间质状态和从更多的间质状态过渡到上皮状态可能有着不同的替代信号通路。我们预计,未来的单细胞分析、数学建模和全基因组CRISPR筛选将为各种EMT和MET过程的动态变化提供更多的见解。



观点


在正常和肿瘤性上皮组织中,EMT过程与干细胞状态密切相关。然而,我们目前对其中的生物机制还缺乏清晰的认识。EMT可能使正常和肿瘤干细胞产生哪些重要的分子变化和细胞特征?


我们注意到,在某些情况下,在正常组织中发生的干细胞过程与来自这些组织的肿瘤中说发生的干细胞过程之间可能存在着巨大的差异。例如,小鼠造血干细胞需依赖于SLUG,而小鼠乳腺癌的造血干细胞则会优先激活其同源物SNAIL。虽然这两个类似的转录因子可能调节着一组共同的干性相关靶标,但它们所调节的转录过程有很大的差异。尽管有这些差异,我们还是推测EMT过程的某些方面与干细胞状态有着根本性的关系(图5)。





EMT和肝细胞状态之间的机制联系


早期的研究发现了EMT过程与作为干细胞经典表观遗传调控因子的已知蛋白质和microRNAs之间的关联,如原癌基因BMI1对干细胞的自我更新很重要。事实上,ZEB1和TWIST1都能导致BMI1发生上调。相反,能诱导MET的蛋白激酶A(PKA)的激活会抑制正常乳腺基底细胞的自我更新,并通过抑制SOX4而抑制小鼠乳腺肿瘤模型中的CSC潜能,从而突出了EMT和干细胞自我更新之间的另一种分子联系。


EMT过程也可能在控制干细胞对称和不对称分裂的微妙平衡中发挥更直接的作用。例如,SNAIL能促进CSCs和正常组织的细胞向对称性分裂转变。也有可能是EMT调节了老化细胞器的不对称分配,而这与干细胞的维持有关。需要注意的是SNAIL和TWIST已被证明可促进p53的降解,因为p53的缺失能增强MaSCs和CSCs的自我更新分裂。


EMT-TFs,包括ZEB1和SLUG,在DNA损伤反应中稳定,并促进DNA修复,这也提现了EMT在保护干细胞基因组方面的直接作用。事实上,乳腺上皮细胞中SLUG的缺失可导致DNA损伤的积累并加速MaSCs的老化。这些与DNA损伤机制有关的生化机制联系可能促进了CSCs对化疗的抵抗性。


细胞进入准间质状态也可能与某些干性促进信号的激活有关,如那些由WNT、Notch、Hedgehog或YAP途径转导的信号,所有这些都经常被牵涉到对正常干细胞和CSCs的控制。EMT过程改变了与ECM的粘附作用,并被证明有助于形成含有β1-整合素的丝状突起,这反过来又与肿瘤的发生和转移能力有关。因此,EMT过程被激活,可影响细胞对生态位信号的反应,这对诱导或维持干性至关重要。


上皮-间质的可塑性可能使某些干细胞能够产生适应性变化以承受住环境压力,最终存活下来并重新填充组织或肿瘤。虽然干细胞和CSCs确实可能通过不同的状态过渡并受益于EMT可塑性,但我们也注意到,可塑性本身可能不是干细胞活性所必须的,因为一直处在在部分间质CSC状态的细胞仍然具有高度致瘤性。


与干细胞有关的代谢物是细胞分化和增殖的重要调节因素。例如,人类肺部CSCs已被证明其蛋氨酸循环的通量会增加,而且蛋氨酸是其致瘤能力的特别需要。由于许多代谢变化都已被发现会伴随EMT的发生,因此这种转变可能会赋予一些对干细胞有利的代谢适应性。


现在和可预见的未来科学家们所面临的挑战是如何将这些机制联系起来并发展成一个统一的上皮干细胞状态生物模型,以阐述这种细胞精确的准间质表型,将EMT和干性机制相结合起来的相对重要性,以及它们之间的整合可帮助大家更好地了解它们在CSCs中的相似或差异。揭示EMT和干细胞状态之间的联系将有助于阐明干细胞在不同上皮层中所共有的基本过程,并将揭示这些过程是如何被CSCs所应用或阻碍,从而促进癌症的发生。



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