染色质修饰包括组蛋白转录后修饰，组蛋白多样性。连同DNA一起调控表观遗传表型。虽然染色质修饰在多种生理学过程和人类疾病中都有重要的意义，但是由于此前存在的技术检测通道有限，无法同时检测各种免疫细胞亚群特异性marker和各种染色质修饰。因此在人类免疫细胞中进行染色质研究具有挑战性。近期出现的一个技术突破——质谱流式技术，可以在少量细胞甚至是单细胞中进行四十种以上参数采集，可以完美应对这一挑战。斯坦福大学Alex J. Kuo实验室利用该技术，设计了进行表观遗传研究的Panel Assay——epiTOF，将其运用到免疫细胞的组蛋白转录后修饰研究上。其成果近期（2018年5月）在Cell上发表。在文章中，利用epiTOF对人的免疫细胞进行单细胞分析，描述了不同免疫细胞亚群中染色质修饰种类和水平概观。其实验结果揭示了1根据染色质修饰形态可将免疫细胞分出特定亚群。2个体和细胞之间的染色质修饰多样性随着衰老而增加。3与衰老相关的染色质修饰变化主要受到非遗传因素的影响。 这一研究把质谱流式技术的应用扩展到表观遗传学领域。
该研究选取24位健康人PBMC样本，在22种主要的免疫细胞亚群中检测8种组蛋白修饰类型和4种组蛋白（组蛋白类型和修饰类型请见Fig1），每个细胞中采集和分析的参数达到70种以上。由于质谱流式检测到的数据是多参数和单细胞的，因此可以根据免疫细胞的染色质修饰情况进行表观遗传分群。结果显示，静息的免疫细胞显示出亚群特异的染色质修饰特征；淋巴来源和骨髓来源的免疫细胞具有各自特异的标记特征；单细胞的染色质修饰组成的分子标记可以预测该细胞的类型。作者把24位健康人分为两组进行研究，每组包括6位25岁以下的年轻人（3男3女）和6位65岁以上的老年人（3男3女），通过年轻人和老年人的染色质修饰情况对比发现，随着衰老，个体间和细胞间的染色质修饰差异性显着增加。对于19对双胞胎的染色质修饰研究发现，70%的差异性增加情况是由于环境因素导致的。总之，这篇文献开发了一个高通量多参数的研究方法，用于人类免疫细胞中进行单细胞水平的染色质修饰研究，研究结果揭示了衰老影响表观遗传的机制以及自然和营养在衰老的人类细胞中染色质动态中的相关贡献。
Fig1 文章的整体研究思路和发现。作者利用质谱流式技术，对人免疫细胞样本中的4种组蛋白，8种组蛋白修饰类型进行研究分析，结果显示修饰具有细胞类型特异性和谱系特异性。随着衰老，细胞间和个体间的差异性增加，通过对双胞胎群体的研究发现，这一衰老相关的表观遗传变化主要是受到非遗传性因素的影响。
作者首先对免疫细胞亚群中的各种染色质修饰概况进行了研究（Fig2，对应原文Fig1C）。染色质修饰数据的标准化是采用线性回归模型，利用整体组蛋白表达作为预测变量。数据分析集中在修饰水平和差异性。整体变化如Fig2所示。修饰具有亚群特异性，比如，CD4+T细胞和CD8+T细胞表现出相似的修饰表型，NK细胞的所有修饰水平相对于其他亚群都处于低水平。此外，在CD14+ Monocytes中，cleaved H3 Thr22修饰以及PADI4表达水平显着升高。而组蛋白变体H3.3表达和H3K27me修饰水平下降。逆辛普森多样性指数分析（ISDI）显示cleaved H3 Thr22和H2A.Z修饰具有最大的样本间差异性，macroH2A， PADI4，和H2BK120ub显示出最小的样本间差异性等。对于以上发现，作者采用传统流式进行了验证，结果完全一致。聚类算法显示，骨髓来源的免疫细胞相对于淋巴来源的免疫细胞具有以下特征： H3.3和H3K27me3修饰水平降低，cleaved histone H3 Thr22， H3K36me1水平升高， PADI4 表达。此外作者还发现H3K27me3的赖氨酸甲基化转移酶EZH1和 EZH2在淋巴前体细胞和T细胞中的表达量远高于骨髓前体细胞和Monocytes。这个发现支持了H3K27me3修饰水平区别决定HSC分化方向的假说。作者随后进行的ChIP-seq研究结果同样验证了这一结论。
Fig2 免疫细胞亚群中的各种染色质修饰概况。图中展示了不同免疫细胞亚群中各种组蛋白修饰的水平和样本间差异性。
随后作者对于质谱流式所得到的单细胞多参数数据进行了PCA分析，结果显示，基于染色质修饰类型及水平同样可以将各种免疫细胞亚群区分开来，其中， 骨髓来源的Monocytes和其他亚群的区分度更高，这同样支持了骨髓来源和淋巴来源的免疫细胞染色质修饰具有其特异性这一结论（Fig3，对应原文Fig2A）。
Fig3 基于染色质修饰类型及水平对免疫细胞进行分群。其中骨髓来源的Monocyte和其他免疫细胞亚群展现出更大的差异性。
得到以上结论后，作者将研究集中在11种T细胞亚群中，检测了40种染色质修饰。基于染色质修饰结果的聚类分析自动分出了αβ T细胞和γδT细胞亚群，说明这两个亚群的染色质修饰具有特异性。Na？ve CD4+ T，Na？ve CD8+ T以及Effector，Memory T细胞各自被自动聚类在一起，这说明T细胞亚群的染色质修饰具有功能特异性。这些结果显示，T细胞亚群的染色质修饰具有可塑性，很可能是根据其在获得性免疫中的特定免疫功能进行重置。与分化初期的Na？ve T细胞相比，在分化终端的Memory T细胞中， H3S10ph（在正在转录基因的启动子处会被检测到）修饰水平显着上调。与此同时，常染色质相关的H3K27me1和H3K36me1两种修饰水平也出现上调，异染色质相关的组蛋白修饰H3K27me3， H4K20me3，和H3K9me2修饰水平出现下调。这些发现说明Memory T细胞中的染色质处于更加易于转录的状态。与所有CD4+T细胞相比，在Treg中，H3K27me1 和 H3K27ac修饰显着上调，H3K27me3修饰水平显着下调。预示了在Treg中进行以上修饰生物学研究的重要性。除了T细胞以后，作者对于CD56bright和CD56dim的NK细胞染色质修饰也进行了分析，发现CD56bright NK细胞和CD56dim的NK细胞或者其他淋巴来源的免疫亚群无法聚类在一起，这预示了CD56bright NK细胞与CD56dim的NK细胞很可能来源于不同的干祖细胞（Data not shown，请参考原文Fig3D and Fig3E）。
Fig4 T细胞亚群中，染色质修饰概况。T细胞亚群的染色质修饰具有功能特异性。
完成在不同细胞亚群中的染色质修饰研究以后，作者把研究转向在衰老过程中染色质修饰的变化情况。对比了12个25岁以下的年轻人和12个65岁以上的老年人的染色质修饰情况（涉及40种染色质修饰和20种免疫细胞亚群，共计800种数据点），结果显示随着衰老，大多数免疫细胞中的多数修饰水平均有增加，但是CD45RO+CD197+ central memory CD8+ T细胞中的共检测了40种修饰，其中34种水平降低。这暗示着central memory CD8+ T细胞中的染色质衰老机制很可能是独有的。除此之外，作者对于年轻人和老年人的样本进行了多重t-TEST分析，对比前述800种数据点的CV值，结果显示其中61.8%的数据点在老年样本中呈现了更高的细胞间差异性。这些差异性增加的修饰包括H3K27me3， H3K27me2 H2AK119ub， 这些修饰都是由polycomb抑制性复合物1或者2 (PRC1 或 PRC2)催化（Fig5）。此前有报道显示PRCs在转录沉默和染色质致密化过程中有重要作用(Margueron and Reinberg， 2011). H3K4me3在多种免疫细胞亚群中随着年龄的增加没有发生显着变化，进一步的研究发现，随着衰老，H3K27me3 标记的基因的转录水平变化相对于H3K4me3标记的基因转录水平表现出更大的差异性。这一发现预示了下述模型：随着衰老而提高的表观遗传噪音，尤其是PRC介导的H3K27me3，导致了单细胞之间染色质状态的差异，并最终引发了衰老进程中转录噪音的增加。
Fig5在衰老过程中染色质修饰的变化情况
作者提出的问题是衰老过程中的差异性增加是否由遗传性因素决定。选取了9对同卵双胞胎和10对异卵双胞胎进行研究。利用经典的ACE模型分析数据得出结论如下：70%的组蛋白差异性取决于非遗传性因素（其中包括13.5%的共享环境因素和56.5%的特有环境因素），30%差异性取决于遗传性因素。其中CD45RO-CCR7+ naive， CD45RO+CCD7+ central memory和CD45RO+CCD7- effector memory CD4+ T 细胞在CD4+ T细胞中的占比由遗传因素决定。
REFERENCE
PeggieCheung， et al.， Single-Cell Chromatin Modification Profiling Reveals Increased Epigenetic Variations with Aging. Cell， 2018.
转化医学动态
